关键词:Western blot;蛋白;样品;制备

     

     

    物品准备: 10mg/ml标准蛋白、1xPBS、BCA试剂盒、96孔板、微量移液器、37℃恒温培养箱、酶标仪、RIPA(强)裂解液、5x上样缓冲液、水浴锅、电磁炉、

    8.2.2 蛋白样品的浓度测定及制备

    1)蛋白标准品的制备:取出50ml浓度为10mg/ml的蛋白质标准品,每次各汲取25ml 1XPBS倍比稀释蛋白标准品如下

    2)蛋白样品浓度的测定

    1)每个待测蛋白样品取5ml稀释5倍至25ml;

    2)BCA工作液:A:B=50:1 ;

    3)将蛋白标准品和待测蛋白样品加到96孔板中(5ml/孔,设复孔);

    4)每个孔加95ml BCA工作液,放入37℃恒温培养箱孵育30min;

    5) 酶标仪测分光光度值(562nm波长);

    6)根据蛋白标准品标准曲线算出待测蛋白样品的终浓度;

    7)用RIPA裂解液和5x上样缓冲液将蛋白样品最终浓度稀释到2mg/ml;

    8)上述稀释好的蛋白样品放置沸水中5-10min,之后直接后续步骤后者分装-80℃保存。